Nuova piattaforma personalizzata di microscopia ottica

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"L'operazione di riconoscimento e misura di microrganismi bentonici di interesse è stata automatizzata con vantaggi in termini di tempo e fatica."

- Alessandro Lugli, SITEM

The Challenge:
Disporre di un set-up motorizzato per microscopia ottica che fosse versatile e di facile utilizzo anche per operatori non esperti e dal costo più contenuto possibile, senza sacrificare le prestazioni. A titolo di esempio, l’applicazione per la quale si vuole utilizzare il presente set-up è la determinazione di microalghe bentoniche in acqua di mare.

The Solution:
Utilizzo di una soluzione personalizzata che integra hardware commerciale modulare e che dispone di un software appositamente realizzato in ambiente NI LabVIEW.

Author(s):
Alessandro Lugli - SITEM
Guido Giorgi - VACUUMFAB
Massimo Vassalli - CNR Genova

SITEM
SITEM è una azienda genovese attiva da 16 anni nel settore del test, della misura e dell'automazione industriale. SITEM è Silver Alliance Partner di National Instruments dal 2000.

Vaccum Fab
Vacuum FAB è presente da 15 anni nel mondo della ricerca e dell'industria, e vanta una notevole esperienza nella progettazione e realizzazione di sistemi di micro posizionamento di precisione per applicazioni di microscopia, ottica, UHV e acquisizione dati.

CNR-IBF
L'Istituto di Biofisica nasce dall'aggregazione di cinque preesistenti strutture del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), distribuite su tutto il territorio nazionale (Genova, Milano, Palermo, Pisa e Trento) e da una vasta gamma di attività di ricerca aventi come principale comune denominatore l'applicazione di metodi e tecniche di indagine propri delle scienze fisiche allo studio dell'organizzazione, della struttura e dei meccanismi di funzionamento dei sistemi biologici. L'Istituto si dedica in maniera significativa anche allo studio, ancora con metodologie fisico-chimiche, dell'impatto di fattori ambientali, sia antropici che non, sugli ecosistemi.

Il sistema

Hardware
Vacuum FAB propone video-microscopi motorizzati ritagliati sulla specifica applicazione che coniugano versatilità, automazione, prestazioni e, non per ultimo, i costi. Per questa applicazione è stato progettato un microscopio biologico a trasmissione integrando componenti modulari standard QIOPTIQ della serie Optem FUSION. Lo schema ottico è quello di un microscopio biologico invertito con un obiettivo 10X ad alta risoluzione e lunga distanza di lavoro (fig. 1).
È previsto un doppio sistema di illuminazione a led in grado di fornire sia luce trasmessa a campo chiaro, sia fluorescenza. Questa soluzione permette di separare agevolmente gli organismi contenenti clorofilla (e quindi fluorescenti, come le alghe) da organismi non fotosintetici, permettendo una più semplice identificazione degli organismi potenzialmente di interesse, che vengono poi caratterizzati e ulteriormente riconosciuti in luce trasmessa.

Il microscopio è gestito completamente in remoto, in maniera automatica: la scansione del campione viene fatta con il tavolino XY di precisione BioScan_INV_K01 che integra cuscinetti a ricircolo di sfere, viti/chiocciole a passo fine con trattamento superficiale che ne garantisce le prestazioni per milioni di cicli, motorini passo-passo e righe ottiche lineari di risoluzione 0.05µm. Questa meccanica è compatibile con lo standard di porta-campioni K-frame.
La messa a fuoco avviene muovendo il microscopio su di una slitta di precisione con cuscinetti a rulli incrociati e vite a ricircolo di sfere che, con un motorino passo-passo, permette una risoluzione di posizionamento di 0.1µm.

L'elettronica di controllo Phytron phyMOTION permette il controllo dei tre assi motorizzati sia tramite un joystick analogico integrato nella base dello strumento che tramite il computer.
Il microscopio FUSION Inv_Fluo_Led_01 sopra descritto monta una telecamera Gig-E DMK 23G274 della The Imaging Source (con CCD b/n Sony da 1/1.8") che, con un obiettivo 10X M Plan permette in questa configurazione una risoluzione finale di 1µm in un campo di vista di 0,53x0,71mm2 .
Questo video-microscopio è pensato per essere appoggiato su una scrivania o un tavolo da laboratorio,  integra una base isolante a nido d'ape e una robusta colonna di sostegno in alluminio (fig. 2).

Software
Il software per la gestione del microscopio è stato sviluppato da SITEM in ambiente NI LabVIEW. . Esso automatizza tutte le funzioni del microscopio per la movimentazione degli assi, acquisizione e taratura dimensionale delle immagini e per il salvataggio delle stesse (formato Bitmap). Una modalità di funzionamento prevede la possibilità di acquisizione di uno stack di immagini la cui spaziatura verticale è impostata attorno alla posizione di miglior fuoco. 

La precisione della meccanica di movimentazione Z ha permesso anche l’implementazione di un algoritmo di messa a fuoco. Essa si basa sulla determinazione del massimo contrasto rilevato su una serie di immagini acquisite a differenti Z, eseguendo una elaborazione basata su una FFT delle immagini. La routine di ricerca dell’autofocus può essere seguita durante le misure ogni N immagini allo scopo di compensare eventuali disallineamenti delle facce del contenitore (cella Petri).

Avendo l’esigenza di osservare l’intero campione in esame, è stata messa a punto una procedura che consente di impostare la mappatura della cella seguendo un percorso 'a serpentina' (con passo scelto dall’utente) sia su area rettangolare che circolare.
Il software consente inoltre di salvare differenti configurazione del sistema che includono, tra le altre, le velocità di movimentazione, quote del fuoco, dimensioni del campioni ecc.
La flessibilità del software di pilotaggio, basato su LabVIEW, ha permesso di integrare una procedura di riconoscimento automatico di immagini realizzata da una azienda partner, che ha realizzato una DLL (Dinamic Link Library). La piattaforma di sviluppo NI ha consentito di integrare facilmente tale DLL all’interno dell’applicativo di gestione della piattaforma hardware, riducendo così i costi e i tempi di sviluppo.

RISULTATI
L'operazione di riconoscimento e misura di microrganismi bentonici di interesse è stata automatizzata con vantaggi in termini di tempo e fatica richiesti all'operatore che non deve più necessariamente essere altamente qualificato. La mappatura di campioni permette un nuovo conteggio, dove richiesto, impensabile prima dell'automazione.
La soluzione tecnica ritagliata sulla specifica applicazione risulta comunque conveniente dal punto di vista economico rispetto all'investimento richiesto per un microscopio biologico da laboratorio motorizzato, a parità di qualità e prestazioni ottiche. Il sistema ottico modulare permette di essere comunque riconfigurato in futuro per altre applicazioni di microscopia.

Author Information:
Alessandro Lugli
SITEM

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